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Nature Biomedical Engineering (2023)この記事を引用 3609 アクセス 110 Altmetric Metrics の詳細プラークアッセイ - 複製能力のある溶解物質の濃度を測定するためのゴールドスタンダード方法

Nature Biomedical Engineering (2023)この記事を引用

3609 アクセス

110 オルトメトリック

メトリクスの詳細

プラークアッセイ (複製能力のある溶解ビリオンの濃度を測定するための代表的な方法) では、染色が必要で、通常は 48 時間以上の実行時間が必要です。ここでは、レンズフリーのホログラフィックイメージングと深層学習を組み合わせて、アッセイを迅速化および自動化できることを示します。このコンパクトなイメージングデバイスは、ウェルごとに 1 時間あたり約 0.32 ギガピクセルの速度でラベルフリーの位相情報を取得し、約 30 × 30 mm2 の領域と標準的なアッセイよりも 10 倍大きいウイルス濃度のダイナミックレンジをカバーし、感染ウイルスを定量します。面積とプラーク形成単位の数。水疱性口内炎ウイルスの場合、自動プラークアッセイは、ウイルス複製によって引き起こされる最初の細胞溶解イベントを、インキュベーション後早ければ 5 時間で検出し、20 時間以内に 100% で 90% 以上の割合でプラーク形成単位を検出しました。特異性。さらに、単純ヘルペスウイルス 1 型の潜伏時間を約 48 時間、脳心筋炎ウイルスの潜伏時間を約 20 時間短縮しました。染色のないアッセイは、ウイルス研究、ワクチン開発、臨床診断での使用に適している必要があります。

ウイルス感染は、インフルエンザ、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトパピローマウイルスなどの感染症を通じて、世界中で何百万人もの人々に影響を与える可能性があります1。米国疾病管理予防センターは、2010 年以降、インフルエンザウイルスにより米国だけで 1,600 ～ 5,300 万人の病気、200 ～ 100 万人の入院、16,700 ～ 66,000 人の死亡者をもたらしたと推定しています2,3。さらに、世界中で 5 億人以上の感染者と 600 万人以上の死者を出した新型コロナウイルス感染症のパンデミックは、多くの国の公衆衛生と社会経済的発展に多大な負担をもたらしています4。このような世界的な健康問題への対処を支援するには、臨床診断 5、ワクチン開発 6、および組換えタンパク質 7 や抗ウイルス剤 8,9 の製造のために、正確かつ低コストのウイルス定量技術を開発する必要があります。

1952 年に開発されたプラークアッセイは、ウイルス濃度を定量化するための最初の方法でした。 Renato Dulbecco によって進歩したこのアッセイでは、複製能力のある溶解ビリオンを含む所定のサンプル中のプラーク形成単位 (PFU) の数を手動で測定できます 10,11。これらのサンプルは段階的に希釈され、各希釈液のアリコートが培養細胞の入ったディッシュに加えられます10。ウイルスが隣接する細胞に感染して広がると、プラークが徐々に形成され、専門家が視覚的に検査することができます。費用対効果の高い方法でウイルスサンプルの感染力を提供する独自の機能により、プラークアッセイは、他の方法が存在するにもかかわらず、ウイルス濃度を定量化するためのゴールドスタンダードの方法であり続けています12、13、14、15、16、17。、１８、１９、例えば、免疫蛍光焦点形成アッセイ１４、ポリメラーゼ連鎖反応１６、および酵素結合イムノアッセイベースのアッセイ１９、２０。ただし、プラークアッセイでは、プラークが目に見えるサイズに拡大するまでに通常 2 ～ 14 日のインキュベーション期間が必要であり (ウイルスの種類と培養条件に応じて)21、手動によるプラーク計数プロセスでは人的ミスが発生する可能性があります22。従来のプラークアッセイを改善するために、多数の方法が開発されてきました23。多くのシステムにはウェルプレート内の細胞培養を画像化する独自の機能がありますが、蛍光マーカー 22 または金微小電極を備えた特別な培養プレート 24 のいずれかが必要です。さらに、これらの方法では人間による数え間違いが依然として問題として残っています。したがって、正確、定量的、自動化され、迅速かつ費用対効果の高いプラークアッセイは、ウイルス学研究および関連する臨床応用にとって有利である。

定量的位相イメージング (QPI)、ホログラフィー、および深層学習における最近の開発の一部は、このニーズに対処する機会を提供します。 QPI は、非侵襲的かつラベルフリーの方法で透明な生体標本の視覚化と定量化を可能にする優れたイメージング技術です 25,26。さらに、QPI システムの画質は、ニューラルネットワークを使用して、特に位相回復 27、ノイズ低減 28、自動焦点 29、30、および空間解像度 31 を改善することによって向上させることができます。さらに、QPI32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42 を使用した、ディープラーニングベースの微生物の検出および同定方法が数多く示されています。

90% PFU detection rate in <20 h, providing major time savings compared with the traditional plaque assays, which take ≥48 h. Furthermore, we show an average incubation time saving of ~48 h and ~20 h for HSV-1 and EMCV, respectively, achieving a PFU detection rate >90% with 100% specificity. A quantitative relationship was also developed between the incubated virus concentration and the virus-infected area on the cell monolayer. Without any extra sample-preparation steps, this deep-learning-enabled label-free PFU imaging and quantification device can be used with various plaque assays in virology and might help to expedite research in vaccine and drug development./p>95% coverage. During the virus infection, five wells were infected by 100 µl of the diluted VSV suspension (obtained by diluting a 6.6 × 108 PFU ml−1 VSV stock with a dilution factor of 2−1 × 10−6), and one well was left for negative control. Then, 2.5 ml of the overlay solution containing the total medium with 4% agarose was added to each well (see Methods for details, ‘Preparation of agarose overlay solution’). After the solidification of the overlay at room temperature, each sample was first placed into our imaging set-up for 20 h of incubation, performing time-lapse imaging to capture the spatiotemporal information of the sample. Then, the same sample was left in the incubator for an additional 28 h to let the PFUs grow to their optimal size for the traditional plaque assay (this is only used for comparison purposes). Finally, each sample was stained using crystal violet solution to serve as the ground truth to compare against our label-free method./p>90% at 20 h of incubation without having any false positives at any time point despite using no staining./p>1%), a faster PFU concentration readout can be provided at 12 h or 15 h. As the size of an average PFU on the well is physically larger at 15 h of incubation compared with 12 h, the slope of the red calibration curve in Fig. 6b is smaller than in Fig. 6a, as expected. For samples with even higher virus concentrations, the infected cell area percentage could reach >1% in ≤10 h of incubation (shown in Fig. 5c), providing the PFU concentration readout even earlier./p>70 °C during its operation, which could disturb the growth of the sample and vaporize the agarose layer, especially for regions that are near the sensor parking location between successive holographic scans. Hence, a cooling system was built using fans (QYN1225BMG-A2, Qirssyn). We also sealed the sides of the sample using parafilm (product number 13-374-16, Fisher Scientific) and opened four holes on the top cover to form a gentle ventilation system, which is an inexpensive and easy-to-implement solution to avoid sample drying./p>90% detection rate for VSV PFUs with 100% specificity in <20 h./p>11 TB) is available from the corresponding author on reasonable request./p>

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